A reakciófeltételek optimalizálása a stevia rebaudioside d nagy hozamának eléréséhez
A magas cukros étrendek különféle krónikus betegségek, köztük az elhízás, cukorbetegség, szív- és érrendszeri betegségek és a magas vérnyomás gyakoriságának növekedéséhez vezettek, ami jelentős globális közegészségügyi problémát jelent. A Stevia Rebaudioside D (Reb D), egy növényi alapú természetes édesítő, jelentős figyelmet kapott cukorhelyettesítőként nulla kalóriatartalom, intenzív édessége és kellemes ízprofilja miatt.
Azonban a stevia rebaudiana Bertoniban található korlátozott jelenléte, valamint a növényi eredetű glikosiltranszferáz alacsony oldhatóságával és enzimatikus aktivitásával kapcsolatos kihívások miatt megnehezítette széles körű kereskedelmi alkalmazását. Ezekre a problémákra válaszul felfedeztek egy új glikoziltranszferázt, a YojK-t, amely a Bacillus subtilis 168-ból származik. Ez a tanulmány egy genetikailag módosított bakteriális glikosiltranszferázt, a YojK-I241T/G327N-t mutat be, amelyet magas oldhatóság és katalitikus hatékonyság jellemez, nagy potenciált kínálva az ipari méretű Reb D előállítására.
Egy rendkívül hatékony módszer kidolgozása a rebaudioside D előállítására YojK-I241T/G327N és AtSuSy enzimek kaszkád reakciójával.
A növényi eredetű glikoziltranszferázok alacsony oldhatóságának problémájának kezelésére kutatók vizsgálták a YojK, egy O-glikoziltranszferáz alkalmazásának lehetőségét a Bacillus subtilis 168-ból. A YojK-t azért választották, mert különböző szubsztrátokkal, köztük nagy molekulákkal, bizonyított glikozilációs aktivitása mutatott volt. A sikeres rekombináns expresszió és tisztítás után YojK-t alkalmazták a Reb A glikozilálására, ami Stevia Reb D termeléséhez vezetett. Az enzimkinetikus elemzés kimutatta, hogy a YojK kisebb katalitikus aktivitással rendelkezik a Reb D felé más glikosiltranszferázokhoz képest. Ennek következtében a tanulmány azt sugallja, hogy a szerkezetvezérelt mérnökség szükséges a YojK katalizátori aktivitásának fokozása érdekében a lehetséges gyakorlati alkalmazásokhoz. (ahogy az 1. ábrán látható)
1. ábra
A reakciófeltételek optimalizálása a rebaudioside D nagy hozamának eléréséhez.
A reakciókörülmények, beleértve a pH-t, a hőmérsékletet és a szubsztrát koncentrációját, optimalizálhatók a magas Srevia Reb D hozamért. A tanulmány molekuláris dinamikai szimulációkat használt annak vizsgálatára, hogy a YojK-I241T/G327N variáns miként fokozza a Reb D glikozilációját. A változat stabil hidrogénkötést tartott fenn a Reb A és H14 között a szimulációk során, ellentétben a vadtípussal (ahogy a 2. ábrán látható). Ez a stabilitás kiterjedt a Reb A O2 atomja és az UDPG C1P közötti távolságra is. A YojK-I241T/G327N változat javult katalitikus hatékonyságát ezeknek a stabil kölcsönhatásoknak tulajdonították, ami gyakorlati potenciálját jelezte.
2. ábra
3. ábra
Összegzés
Ez a megközelítés 83,47% Reb D-t eredményezett. Figyelemre méltó, hogy 1 mM UDPG hozzáadása lehetővé tette 20,59 g/L Reb D szintézisét figyelemre méltó 91,29%-os termelmenéssel, meghaladva korábbi tanulmányokat. Ez a folyamat bizonyítja az ipari méretű Reb D gyártás lehetőségét, különösen a YojK szerkezeti mérnöksége után.A YojK hatékonyan kifejezhető E. coli BL21 (DE3) változatban, amely magas oldhatósággal rendelkezik. Szerkezetvezérelt mérnöki munka révén létrehoztak egy dupla mutánst, a YojK-I241T/G327N-t, amely lehetővé tette a Reb D nagyszabású előállítását kivételes 91,29%-os hozammal, UDPG újrahasznosításával, amelyet szacharóz-szintáz AtSuSy katalizált. Ez a tanulmány a YojK-I241T/G327N-t ígéretes eszközként mutatja be gazdaságilag hatékony, ipari méretű Reb D gyártáshoz.
