Reakció a magas hozam elérésére Stevia Rebaudioside D (Reb D) a Reb A-ból

A magas cukortartalmú étrend a különböző krónikus betegségek, köztük az elhízás, a cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek és a magas vérnyomás növekvő előfordulásához vezetett, ami jelentős globális közegészségügyi problémát jelent. A Stevia Rebaudioside D (Reb D), a növényekből származó természetes édesítőszer cukorhelyettesítőként jelentős figyelmet kapott nulla kalóriatartalma, intenzív édessége és kellemes ízprofilja miatt.
Azonban a stevia rebaudiana Bertoniban való korlátozott jelenléte és a növényi eredetű glikoziltranszferáz alacsony oldhatóságával és enzimatikus aktivitásával kapcsolatos kihívások akadályozták széles körű kereskedelmi alkalmazását. Ezekre a problémákra válaszul felfedezték a YojK nevű új glikoziltranszferázt, amely a Bacillus subtilis 168-ból származik. Ez a tanulmány egy genetikailag módosított bakteriális glikoziltranszferázt, a YojK-I241T/G327N-t mutatja be, amelyet nagy oldhatóság és katalitikus hatékonyság jellemez, és amely nagy potenciált kínál a Reb D ipari méretű előállításához.

Rendkívül hatékony módszer kifejlesztése a rebaudiozid D előállítására YojK-I241T/G327N és AtSuSy enzimek kaszkádreakciójával.

A növényi eredetű glikoziltranszferázok alacsony oldhatóságának problémájának kezelésére a kutatók megvizsgálták a YojK, a Bacillus subtilis 168-ból származó O-glikoziltranszferáz használatának lehetőségét. A YojK-t azért választották, mert kimutatták glikozilációs aktivitását különböző szubsztrátokkal, beleértve a nagy molekulákat is. A sikeres rekombináns expresszió és tisztítás után a YojK-t a Reb A glikozilálására alkalmazták, ami Stevia Reb D termelését eredményezte. Az enzimkinetikai elemzés kimutatta, hogy a YojK alacsonyabb katalitikus aktivitással rendelkezik a Reb D felé, mint más glikoziltranszferázok. Következésképpen a tanulmány azt sugallja, hogy szükség van a szerkezetvezérelt tervezésre, hogy fokozza a YojK katalitikus aktivitását a lehetséges gyakorlati alkalmazásokhoz. (az 1. ábrán látható módon)

1. ábra

A reakciófeltételek optimalizálása a rebaudiozid D magas hozamának elérése érdekében.

A reakciókörülmények, beleértve a pH-t, a hőmérsékletet és a szubsztrátkoncentrációt, optimalizálhatók a Srevia Reb D magas hozamának elérése érdekében. A tanulmány molekuláris dinamikai szimulációkat használt annak vizsgálatára, hogy a YojK-I241T / G327N variáns hogyan fokozza a Reb D glikozilációját. A variáns stabil hidrogénkötést tartott fenn a Reb A és a H14 között a szimulációk során, ellentétben a vad típussal (lásd a 2. ábrát). Ez a stabilitás kiterjedt a Reb A O2 atomja és az UDPG C1P atomja közötti távolságra is. A YojK-I241T/G327N változat jobb katalitikus hatékonyságát ezeknek a stabil kölcsönhatásoknak tulajdonították, ami a gyakorlati potenciáljára utal.

2. ábra

A kutatók kaszkádreakciót alkalmaztak a YojK-I241T / G327N és az AtSuSy enzimek bevonásával. A legfontosabb optimalizálási lépések közé tartozott a pH 8,0 szinten tartása kálium-foszfát pufferben, 35 ° C reakcióhőmérséklet, 10% -os társoldószer DMSO és 400 mM szacharózkoncentráció. (a 3. ábrán látható módon)

3. ábra

Következtetés

Ez a megközelítés 83,47% Reb D-t eredményezett. Nevezetesen, 1 mM UDPG hozzáadásával 20,59 g / l Reb D szintézise lehetővé tette figyelemre méltó 91,29% -os hozammal, felülmúlva a korábbi tanulmányokat. Ez a folyamat demonstrálja az ipari méretű Reb D gyártásban rejlő lehetőségeket, különösen a YojK szerkezettervezése után.
A YojK hatékonyan expresszálható E. coli BL21-ben (DE3), nagy oldhatóság mellett. A szerkezetvezérelt tervezés révén létrehoztak egy kettős mutánst, a YojK-I241T/G327N-t, amely lehetővé tette a Reb D nagyüzemi gyártását kivételes, 91,29% -os hozammal az AtSuSy szacharózszintáz által katalizált UDPG újrahasznosításával. Ez a tanulmány a YojK-I241T/G327N-t ígéretes eszközként mutatja be a gazdaságilag hatékony, ipari méretű Reb D gyártáshoz.