Növekedéshez kötött enzim-mérnökség redox kofaktor regeneráció manipulálásán keresztül

Egyre szélesebb körű vegyi anyagokat állítanak elő megújuló alapanyagokból biotechnológiai módszerekkel. A biofolyamatok nagymértékben támaszkodnak enzimmatikus katalízisre a vegyületek hatékony előállítása érdekében. Ezért kiemelt fontosságú a fenntartható termelés szempontjából, hogy az enzimek optimális teljesítményt nyújtsanak a szükséges környezetükben.

Az olyan tulajdonságok, mint az alszubtrét-specifikusság, a katalitikus sebesség és (termo)stabilitás néhány kritikus tényező közé tartoznak, amelyeket optimalizálni kell a hatékony, enzimvezérelt biofolyamatokhoz. Ez az optimalizálás időigényes, költséges és kihívást jelenthet, ezért hatékony és költséghatékony lehet a növekedéshez kötött szelekcióhoz; a kívánt tulajdonságokkal rendelkező mérnöki enzimeket nagyon keresett.

A növekedéshez kötött szelekció alkalmazásának előnyei az enzimszelekció egyik formájaként, amely magában foglalja az enzim aktivitását a sejt növekedésével. Ez a módszer nagy áteresztőképességű szelekciós stratégiaként használható, és elérhető azzal, hogy a növekedés a cél enzim termékszintézisésétől függ, vagy az enzim aktivitását a sejt globális energiaállapotához kötjük. A szintetikus biológia alkalmazható olyan törzsek tervezésére, amelyek alkalmasak növekedés-alapú szelekcióra, és a legújabb fejlesztések olyan törzsek tervezésére összpontosítottak, amelyek hiányzik a redox kofaktor párok oxidált vagy redukált állapotában, és amelyek enzim-mérnöki platformként szolgálhatnak. Ezeknek a platformoknak a használata felgyorsíthatja a továbbfejlesztett biokatalizátorok és biofolyamatok fejlesztését.

A növekedési kapcsolódás előnyei kofaktor axotróphián keresztül

A kofaktor axotrófá alkalmazásának előnyei bizonyos vegyületek, például lipidek, bioüzemanyagok, gázok, szerves oldószerek vagy polimer vegyületek bioszintézisében részt vevő enzimek mérnöki alkalmazásában. Ez a megközelítés számos egyedi előnyt kínál, többek között azt a lehetőséget, hogy a kívánt terméket függetlenül választhatjuk ki az érdekelt szubsztráttól vagy terméktől, megkönnyítve a javuló enzimatikus aktivitás észlelését, valamint leolvasást biztosítva a javuló enzimatikus aktivitás kimutatásához. Emellett a kofaktor auxotrók növekedési kapcsolódási platformként való használata hasznos, mivel a retox kofaktorok a mikrobiális anyagcserében mindenütt jelen vannak, így a mérnöki stratégiák oldalirányban átvihetők más érdekes mikrobáknak, és az enzimek közvetlenül a kívánt mikrobiális gazda környezetében is megalakíthatók. (1. ábra látható)

1. ábra: Több, széles körben használt szűrési/szelekciós technika összehasonlítása az enzimmérnökséghez

NADH oxidációban hiányzó mutánsok

Az E. coli NADH oxidációja két úton történhet, az oxigén rendelkezésre állásától függően. Aerob körülmények között a NADH főként légzésen oxidálódik, hogy ATP-t termeljen, míg anaerob körülmények között erjesztési útvonalakon keresztül oxidálható, így laktát és etanolt termel. Az E. coli mutáns törzsei, amelyek nem képesek kevert erjesztési útvonalakat használni NADH oxidációhoz anaerob növekedés során, NADH oxidáló útvonalakat vezettek fel különböző vegyületek, például a 2-metilpropán-1-ol, 2,3-butandiol, 1-butanol és L-alanin anaerob szintéziséhez. Ezeket a mutáns törzseket az enzimek megtervezésére is alkalmazták hasonló redox elvek alkalmazásával, ami jobb változatokat eredményezett. Az így létrejött törzsek más NAD(P)H-függő enzimek és útvonalak megtervezésére is használhatók.

Mutánsok, akik hiányosak a NAD+ redukcióban  

Wenk és munkatársai létrehoztak egy E. coli törzset a dihidrolipoyl-dehidrogenáz (lpd) gén eltávolításával, ami miatt a törzs nem tudott redukáló energiát (NADH és NADPH) előállítani acetát anyagcseréből a piruvat-dehidrogenáz aktivitásának hiánya miatt. Ez okozta a törzs auxotrófiát mutatott meg, amely csökkenti a teljesítményt, amikor aerobikus módon acetáton, mint egyedüli szénforráson nevelték. (2. ábra látható) A törzs képes volt acetáton növekedni, ha felső glikolitos szubsztrátokkal egészítették ki, vagy amikor NAD+-függő formát-, etanol- vagy metanoldehidrogenázokat fejeztek ki a megfelelő szubsztrátokkal. A törzset nem használták enzimmérnökségre, csak redox kofaktor auxotrófiára értékelték.
 

2. ábra: Központi anyagcsere 

NADPH oxidációban hiányzó mutánsok

Két különböző stratégia létezik az NADP+ auxotrófia kiváltására az E. coli-ban, amelyek a glikolitikus útvonal túltermelésére épülnek. Az első stratégia magában foglalja a natív gapA gén törlését és egy heterológ NADP+-függő GAPDH enzim kifejezését, míg a második stratégia a szénáramlás átirányítását a pentóz foszfát útvonalon keresztül irányítja. Az ebből származó törzsek nem tudnak glükózon növekedni, de különböző körülmények között nőnek: az első törzs anaerob körülmények között, a második aerob körülmények között nevel, glicerol alapjaként. Ezeket a törzseket olyan enzimek mérnökségére használják, amelyek jobb tulajdonságokat kínálnak, beleértve az alszpitszet-specifikusságot, a katalitikus aktivitást és a termostabilitást.

NADP+ redukcióban hiányzó mutánsok

Három különböző baktériumot, az E. coli-t, P. putida-t és C. glutamicum-t NADPH-auxotropikusnak alakítottak ki, vagyis a növekedéshez külső NADPH-ra van szükségük. Az E. coli és a C. glutamicum esetében a központi anyagcsere-enzimeket kiiktatták, hogy elkerüljék az NADP+ redukciót, amikor a glükózt szénforrásként szolgáltatták, míg a P. putida esetében a CRISPR/nCas9-asszisztált mérnöki eljárást alkalmazták a célgének sorozatainak megszakítására, hogy megértsék azok redox anyagcserébe való bekapcsolódását. A NADPH-auxotróf törzseket aztán növekedéshez kötött enzim-mérnökséghez használták kofaktorspecifikusság alapján. Egyetlen mutagenezis kör E. coli-val adta elő a leghatékonyabb és legspecifikusabb NADP+-függő formát dehidrogenázt, míg a P. putida és a C. glutamicum az első törzseket fajjukban, amelyeket ilyen mérnöki eljáráshoz lehet alkalmazni.

NMN+ redukcióban hiányzó mutánsok

Kifejlesztettek egy növekedéshez kötött szelekciós rendszert, amely összekapcsolja a kofaktor ciklust és növekedést az NMN+ redukció hiánya alapján. Az E. coli SHuffle törzset alkalmazták, amely két génben is deleciókat hordoz, amelyek a redukált glutation termelésében vesznek részt. Egy NMNH-függő glutation-reduktázt fejlesztettek ki racionális mutagenezis útján, hogy összekapcsolják a folyamatot az NMN+/NMNH ciklusával, és egy NMN+-függő glükóz-dehidrogenázt használtak az NMN+/NMNH kofaktor ciklus és ezáltal növekedés támogatására. A tanulmány először alkalmazta a nem-kanonikus redox kofaktor auxotrófiát növekedéshez kötött enzimmérnökséghez, ami egy termostabil foszfit dehidrogenáz variánst eredményezett, amely in vitro javult katalitikus hatékonysággal és időbeli stabilitással. A munka hasznos törzset nyújt növekedés-kapcsolt enzimmérnöki munkához, amely az NMN+/NMNH ciklustól és az auxotrófizmustól függ egy nem kanonikus redox kofaktor redukált állapotához.

A retox kofaktorok által történő növekedés-kapcsolódás lehetősége hatékony eszközként működött a biokatalizátorok megalkotásában, különösen a fenntartható biotermelés kontextusában. Bár jelentős előrelépés történt a redox kofaktor auxotrróf törzsek létrehozásában, a kijelentés arra utal, hogy még több kutatási irány is van. Az egyik ilyen terület az E. coli-n kívüli szervezetek kofaktor axotróf törzseinek megtervezése, ami új lehetőségeket nyithat meg a növekedéshez kötött enzimfejlesztés számára.

Összességében azt sugallja, hogy a retox kofaktor-alapú növekedés-kapcsolódás alkalmazása jelentős lehetőséget jelent a biokatalízis mérnöki fejlesztésére, különösen olyan termékek előállításában, amelyek nem felelnek meg más nagy áteresztőképességű enzimmérnöki megközelítések követelményeinek. Hangsúlyozza a fenntartható biotermelés érdekében sokoldalúbb és hatékonyabb biokatalizátorok fejlesztésének szükségességét, és hangsúlyozza a kutatás folytatásának fontosságát ezen a területen.


Hivatkozás: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Növekedéshez kötött enzim mérnökség redox kofaktor regeneráció manipulációján, Biotechnology Advances, 2023.