A NAD+ és metabolitjai mennyiségi az egér isizigei
Bevezetés
A nikotinamid adenin-dinukleotid (NAD+) és metabolitjai az öregedésben és a neurodegenerációban felmerülő kulcsfontosságú részei széles körben elismertek. A biokémiai kutatások és beavatkozások előmozdítása érdekében, amelyek az öregedés és neurodegeneratív betegségek elleni célpontot célozzák, rendkívül fontos, hogy pontosan számmullaksítsuk a NAD+ és annak metabolitszintjét a NAD+ mentőútban. Itt egy megbízható és pontos LC-MS/MS módszert alkalmaznak a NAD+ és metabolitszintjeinek számszerűsítésére a normál és sérült egér isigerigben.A NAD+ és metabolitjai számmalizálására szolgáló meglévő módszerek korlátai
A hagyományos módszerek a NAD+ és metabolitjai számszerűsítésére, mint például a HPLC-UV, NMR, kapilláris zóna elektroforézis vagy kolorimetrikus enzimatikus vizsgálatok, különféle kihívásokkal szembesülnek az érzékenységben, szelektivitásban és közvetett mérésben. A sejt- vagy szöveti NAD+ és metabolitok mérésére vonatkozó meglévő LC-MS/MS vizsgálatok esetében még mindig számos nehézséget kell leküzdeni, például a hosszabb futási idők, rossz kromatográfiai retentálási viselkedés és kielégítetlen csúcsformák. Ráadásul ezek a módszerek csak egy-három anyagot fedhetnek le a NAD+ mentési útvonalon.Az LC-MS/MS módszer módosításai
A meglévő LC-MS/MS vizsgálatok alapján a kromatográfiai feltételek, a helyettesítő mátrix és MS/MS feltételek módosításait végzik. Konkrétan 5 μM metilen foszfonsavat alkalmaznak a mobil fázis adalékként, amely kifejezetten elősegíti a jel intenzitását és csúcsformáját. Tekintettel a soha minták viszonylag tiszta és egyszerűségére, valamint kis méretükre, az ultratiszta vizet helyettesítő mátrixként tesztelik. A hidrofil interakciós folyadékkromatográfiai oszlop és hiperkarbonát oszlop helyett a Waters Atlantis Premier BEH C18 AX oszlopot alkalmazzák, amelynek egyedi MaxPeak HPS nagy teljesítményű felületi technológiája (az oszlop belső falának passzivá tétele, fém felület eltávolítása) lehetővé teszi az összes analitás magas reprodukálhatóságát, csúcsszimmetriáját és alapvonalbeli szétválasztását. Ezen túlmenően az MS feltételek optimalizálva vannak úgy, hogy minimalizálják a NAD+ interferenciás jelet a ciklikus adenozin-difoszfát-ribóz (cADPR) csatornában, miközben megtartják a cADPR és a nikotinamid mononukleotid (NMN) válaszát: 4000V ionpermetezési feszültséghez, 450°C turbófűtő hőmérséklethez, 50 psi az 1-es gázhoz, 50 psi a gáz 2-hez, 30 psi függönygázhoz és 12 psi ütközési gázhoz.
Idegminták reprezentációs kromatogramja (normál vs sérült)
Mind az öt analitás eléri a kiindulási szétválasztást, ahol a cADPR érzékeny biomarker a neurodegenerációs modellben. Ebben az esetben az isiýerideg axotómiája aksonális degenerációt okoz, ami csökkent NAD+ szintet és megemelkedett NMN-szintet eredményez a sérült idegekben, ami körülbelül kétszeresére növeli az NMN/NAD+ arányt. Egyidejűleg a nikotinamid (NAM) és az adenozin-difoszfát-ribóz (ADPR) szintje körülbelül kétszeresére csökken, míg a cADPR szintje több mint 8-szorosára emelkedik. Ezek az eredmények összhangban állnak a korábban bejelentett kutatásokkal, igazolva ennek a módosított LS-MS/MS-módszernek a pontosságát a NAD+ és metabolitjai számszerűsítésében.
Összegzés
Ez a módosított LC-MS/MS módszer lehetővé teszi a NAD+, NMN, NAM, ADPR és cADPR hatékony alapvonalbeli szétválasztását rövid, 5 perc alatt, ami hozzájárul különböző neurológiai rendellenességek korai diagnózisához és az öregedési és neurodegeneratív betegségek gyógyszerfejlesztéséhez.Hivatkozás
Ma Y, Deng L, Du Z. Egy LC-MS/MS módszer fejlesztése és validálása a NAD+ és kapcsolódó metabolitok kvantifikálására egér isigegekben, valamint alkalmazása idegsérüléses állatmodellben. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC2012 óta elkötelezett a koenzim és természetes termékek kutatás-fejlesztése, nyersanyagok gyártása és értékesítése mellett, saját tulajdonú gyárakkal, több mint 170 globális szabadalommal, valamint erős kutatási és fejlesztési csapattal. A BONTAC gazdag kutatási és fejlesztési tapasztalattal és fejlett technológiával rendelkezik a bioszintézis területénNAD és elődjei(pl. NMN és NR). Különböző típusú NAD választhatók lehetnek, többek között a NAD ER fokozatú (endoxin eltávolítás), NAD I fokozatú (IVD/táplálékkiegészítők/kozmetikai nyers por), NAD II. fokozatú (API/köztes anyagok) és NAD IV. fokozatú (ha az oldhatóság magasabb követelménye), amelyek liofilizált vagy kristályos por formájában is szolgálhatók. A BONTAC NAD tisztasága elérheti a 98%-ot.
