A NAD+ és metabolitjainak mennyiségi meghatározása egér ülőidegekben
Bevezetés
A nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) és metabolitjainak kulcsfontosságú részei az öregedésben és a neurodegenerációban széles körben elismert. Az öregedést és a neurodegeneratív betegségeket célzó biokémiai kutatások és beavatkozások előrehaladásának ösztönzése érdekében nagy jelentőséggel bír a NAD+ és metabolitjainak pontos számszerűsítése a NAD+ mentési útvonalon. Itt egy robusztus és pontos LC-MS/MS módszert alkalmaznak a NAD+ és metabolitjainak számszerűsítésére normál és sérült egér ülőidegben.A NAD+ és metabolitjai mennyiségi meghatározására szolgáló meglévő módszerek korlátai
A NAD+ és metabolitjainak mennyiségi meghatározására szolgáló hagyományos módszerek, mint például a HPLC-UV, NMR, kapilláris zóna elektroforézis vagy kolorimetriás enzimatikus vizsgálatok, különböző kihívásokkal szembesülnek az érzékenység, a szelektivitás és a közvetett mérés terén. Ami a sejtes vagy szöveti NAD+ és metabolitjainak mérésére szolgáló meglévő LC-MS/MS vizsgálatokat illeti, még mindig sok nehézséget kell leküzdeni, például hosszabb futási időket, rossz kromatográfiás retenciós viselkedést és nem kielégítő csúcsalakokat. Ezenkívül a NAD+ mentési útvonalon csak egy-három anyag fedhető le ezekkel a módszerekkel.Az LC-MS/MS módszer módosításai
A meglévő LC-MS/MS vizsgálatok alapján a kromatográfiás körülményekre, a helyettesítő mátrixra és az MS/MS feltételekre vonatkozó módosításokat végzik. Pontosabban, 5 μM metilén-foszfonsavat használnak mozgófázis-adalékanyagként, amely kifejezetten elősegíti a jel intenzitását és csúcsalakját. Tekintettel a soha nem vett minták viszonylag tiszta és egyszerű jellegére és kis méretére, az ultratiszta vizet helyettesítő mátrixként tesztelik. A hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfiás oszlop és hiperkarb-oszlop helyett a Waters Atlantis Premier BEH C18 AX oszlopot használják, amelynek egyedülálló MaxPeak HPS nagy teljesítményű felületi technológiája (passziválás az oszlop belső falán, a fémfelület kiküszöbölése) lehetővé teszi az összes analit nagy reprodukálhatóságát, csúcsszimmetriáját és alapvonal-elválasztását.Ezenkívül az MS feltételeket úgy optimalizálták, hogy minimalizálják a NAD+ interferencia jelet a ciklikus adenozin-difoszfát-ribóz (cADPR) csatornában, miközben fenntartják a cADPR és a nikotinamid-mononukleotid (NMN) válaszát, 4000 V-tal az ionszórási feszültséghez, 450 ° C-kal a turbófűtés hőmérsékletéhez, 50 psi-hez az 1. gázhoz, 50 psi-hez a 2. gázhoz, 30 psi-hez függönygázhoz és 12 psi-hez ütközési gázhoz.
Idegminták reprezentatív kromatogramja (normál vs sérült)
Mind az öt analit eléri a kiindulási elválasztást, ahol a cADPR érzékeny biomarker a neurodegenerációs modellben. Ebben az ülőideg axotómia axondegenerációt indukál, ami csökkent NAD+ szinthez és emelkedett NMN szinthez vezet a sérült idegekben, ami az NMN / NAD+ arány körülbelül 2-szeres növekedését eredményezi. Ezzel egyidejűleg a nikotinamid (NAM) és az adenozin-difoszfát-ribóz (ADPR) szintje körülbelül 2-szeresére, míg a cADPR szintje több mint 8-szorosára nő. Ezek az eredmények összhangban vannak a korábban jelentett kutatások eredményeivel, amelyek igazolják a módosított LS-MS/MS módszer pontosságát a NAD+ és metabolitjainak számszerűsítésében.
Következtetés
Ez a módosított LC-MS/MS módszer lehetővé teszi a NAD+, NMN, NAM, ADPR és cADPR hatékony kiindulási elkülönítését rövid, 5 perces futási idő alatt, ami hozzájárul a különböző neurológiai rendellenességek korai diagnosztizálásához és az öregedési és neurodegeneratív betegségek gyógyszerfejlesztéséhez.Utalás
Ma Y, Deng L, Du Z. LC-MS/MS módszer kifejlesztése és validálása a NAD+ és a kapcsolódó metabolitok számszerűsítésére egerek ülőidegeiben, valamint alkalmazása idegsérüléssel járó állatmodellben. J Chromatogr A. o. DOI:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC2012 óta foglalkozik koenzimek és természetes termékek nyersanyagainak kutatásával és fejlesztésével, saját tulajdonú gyárakkal, több mint 170 globális szabadalommal, valamint erős kutatás-fejlesztési csapattal. A BONTAC gazdag kutatás-fejlesztési tapasztalattal és fejlett technológiával rendelkezik a bioszintézis területénNAD és prekurzorai(pl. NMN és NR). Különböző típusú NAD-okat kell kiválasztani, beleértve a NAD ER fokozatot (endoxin eltávolítás), NAD I. fokozatot (IVD / étrend-kiegészítő / kozmetikai nyers por), NAD II. fokozatot (API / intermedierek) és NAD IV. fokozatot (ha van bármilyen magasabb igény az oldhatóságra), amelyek liofilizált por vagy kristályos por formájában biztosíthatók. A BONTAC NAD tisztasága meghaladhatja a 98%-ot.
